1、博凌科为解仅供参考一下：流式样品的准备：DNA含量的测定：用本法可以测定细胞周期、细胞倍体和凋亡，在样品的制备中存在的问题主要是细胞的聚集和碎片，建议在固定细胞时加入3％小牛血清。
2、最后，将细胞上流式细胞仪检测。细胞凋亡检测：细胞凋亡的早期就有细胞膜表面破损发生，破损时凋亡细胞表面的磷脂腺丝氨酸（PS）可以从细胞内膜翻转至细胞的外膜。该过程发生在DNA片段化之前，检测PS的表达，能反映早期凋亡。
3、将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙啶（propidine iodide， PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。
4、从细胞凋亡角度看，肿瘤的发生是由于凋亡受阻所致 基于流式细胞术的凋亡检测手段 PS（磷脂酰丝氨酸）在细胞外膜上的检测 PS从细胞膜内侧转移到外侧在细胞受到凋亡诱导后不久发生，可能作为免疫系统的识别标志。
Q1：（AnnexinV-FITC）-/PI+，此区域的细胞为坏死细胞。也可能有少数的晚期凋亡细胞在其中，甚至机械损伤的细胞也包含其中。Q2：（AnnexinV+FITC）+/PI+，此区域的细胞为晚期凋亡细胞。Q3：（AnnexinV-FITC）+/PI-，此区域的细胞为早期凋亡细胞。Q4：（AnnexinV-FITC）-/PI-，此区域的细胞为活细胞。
理论上无染色的细胞室健康细胞，annexin单染的是早期凋亡，双染是中期，PI单染是坏死细胞。其实这个检测的结果是很不准确的，已经逐渐被弃用，而换用其他更加特异敏感的方法，比如活化的caspase等等。
FITC代表的是annexin V 染色， 代表早期凋亡，PI 单染，代表死亡的细胞，双染阳性的是正在凋亡的细胞。
annexin V 单染的细胞是凋亡早期的细胞，而双染是凋亡中期的。需要在散点图上先画出4个象限，位置根据无染色的阴性细胞先定出左下象限。Annexin V是一种检测细胞凋亡的试剂，在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。
annexinV-FITC（FL1 通道）+ PI（FL2通道）双染细胞，FITC阳性＋PI阴性细胞百％就是早期凋亡％。磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。
1、根据你所购买的试剂盒而定，一般是先用70%乙醇先固定，然后加RNA酶和PI，半个小时左右上机检测就可以了.需要注意的就是加酒精固定的时候要用四度预冷的酒精，缓慢的加，边加边晃动细胞，避免细胞黏连在一起.（1）细胞培养 取对数生长期的细胞，按1X106个/mL以1mL体积接种于6孔板内。
2、由于细胞在流式细胞仪中高速移动，因此需要使用固定剂将细胞固定在流道中，以便于检测。如果细胞未经固定剂固定，在过夜后可能会发生漂移或变形，导致检测结果不准确。此外，不固定过夜还可能导致细胞死亡或分解，进一步影响检测结果。所以流式细胞不固定是不可以过夜的。
3、细胞固定：800rpm离心5min，收集细胞沉淀，弃上清，用预冷PBS洗涤两次，加入预冷75%乙醇，于4摄氏度固定4h以上。细胞染色：1500rpm离心5min，弃上清，以3mL的PBS洗涤一次，加入400uL的CCAA溶液（PI染液，engreen），100ulRNaseA（100ug/mL），4摄氏度避光孵育30min。
4、流式检测的是单个细胞，所以你的样本要是单个细胞悬液。如果是来源于组织或者贴壁培养的，需要注意在分离细胞时避免破坏细胞。保持细胞膜表面的完整性。不要过度消化。还有你处理的细胞要保持你所需要检测的本来面目。比如检测凋亡，贴壁细胞不宜用annexin方法，因为会导致大量的假阳性。
5、用1%多聚甲醛固定细胞，待检测。同样使用流式细胞仪检测，计数10，000个细胞。细胞周期、细胞凋亡及DNA倍体分析样品（PI染色）制备：将待测样本制成单细胞悬液，离心去上清。用70%冷乙醇固定，4℃保存至少18小时。
6、使用流式细胞仪检测荧光值，每管计数10，000个细胞。未标记抗体间接免疫荧光标记法过程为：收集2×106细胞，用冷PBS洗涤一次，离心5分钟。 固定、洗涤后，用含0.2% Triton-X100和5%血清的PBS重悬，冰上放置10分钟，再次离心并清洗。
间接免疫荧光法检测CD16 取1×106个细胞，悬浮于100μl 2% BSA中，室温封闭30分钟，加 CD16单克隆抗体（Immunotech SA公司产品），在室温作用30分钟后，用PBS洗涤2次，再悬浮于100μl 2％BSA中，加FITC 标记的羊抗鼠IgG（Gibco公司产品）室温暗染20分钟后洗去二抗。
在外周血，T细胞还需经历外周克隆剔除，剔除与自身抗原反应的细胞，而活化的T细胞在与外来抗原反应后，会通过清除机制被消灭，防止免疫系统功能紊乱。尽管Fas/FasL突变小鼠（lpr和gld）的胸腺选择正常，但它们的外周克隆剔除和活化T细胞清除受损。T细胞在活化后无法被有效清除，导致自身免疫疾病的发生。
小鼠B细胞： CD45R/B220（相应mAb为RA3- 6B2）是小鼠全B细胞最常用标记，但特异性的标记和人相同，仍为CD1小鼠T细胞：小鼠重要的T细胞标记有Thy- 1（CD90）和成熟T细胞标记CD3e。CD4和CD8可用于区别辅助性T细胞和杀伤性T细胞。
染色步骤包括标记CD3ε和CD4，使用固定及渗透缓冲液处理细胞，然后加入IFN-γ和IL-4的抗体，洗涤后上机检测。检测结果示例展示了使用Mouse Th1/Th2 Staining Kit对正常ICR小鼠样本进行的IFN-γ和IL-4的流式检测，包括静息状态和PMA/Ionomycin刺激状态的比较。
1、X轴选择FSC-A，Y轴选择SSC-A。分析凋亡的细胞选择上图所示的细胞群体进行分析。细胞碎片不予分析。在SSC/FSC图中双击“分析的细胞群体”，X轴选择FITC，用来表示AnnexinV-FITC。Y轴选择PE-Texas，用来表示PI。用四分门设门工具界定活细胞和凋亡细胞。
2、细胞周期检测：细胞周期是指从上一次细胞分裂结束到下一次分裂结束的过程，主要由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。在G0/G1期，细胞分裂成两个细胞，或进入静止期（G0期）。G0期与G1期在DNA含量上无法区分，细胞开始合成RNA和蛋白质，但DNA含量仍保持二倍体。
3、试剂盒说明书：1代表细胞收集过程中机械性损伤的细胞，2 代表继发性坏死细胞，4代表凋亡细胞。有资料说：1代表坏死细胞，2代表晚期凋亡细胞，4代表早期凋亡细胞。我就不明白了，既然是凋亡，就算是晚期，细胞膜也会破坏？还有的认为，2象限代表晚期凋亡和继发性坏死的细胞。
4、现在FSC-SSC散点图上gate出你的细胞群，注意不要把小的碎片和死细胞包括进来。就像下图左侧A里一样 然后就是设置单细胞gate，只显示细胞gate的情况下，再设置单细胞gate 这样就把聚集在一起的细胞排除在外。
5、看你用什么染色了，如果只是PI的话，见图1。
6、许多种类的癌基因表达以后，阻断了肿瘤细胞的凋亡过程，使肿瘤细胞数目增加。因此，通过细胞凋亡角度和机制来设计对肿瘤的治疗方法就是重建肿瘤细胞的凋亡信号传递系统，抑制肿瘤细胞的生存基因的表达，激活死亡基因的表达。